تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)

الحسن الرفاعي 19 مايو, 2013 6
تفاعل البوليميراز المتسلسل  (PCR)

 

* تفاعل البوليميرز المتسلسل ( PCR )

- عبارة عن تقنية تقوم بعمل نسخ عديدة لجزء محدد من الـ   DNA  .تم ابتكار هذه الطريقة بواسطة العالم الامريكي والحائز على جائز نوبل كاري ميليس عام 1983  . تكمن الطريقة عبر  التنقل بين درجات حرارة متفاوتة وبشكل مستمر  وباستخدام عدد من المواد التي تساعد    في عملية التضخيم (amplification ) .انزيم (TAG polymerase)  يعمل في درجة حرارة عالية ويساعد في تكوين الـ DNA الجديد عبر إضافة النيكليوتايد (dNTPs) . ايضاُ, يتم استخدام primers  لتحديد موقع الجزء المراد نسخة من على الـ DNA .

* مراحل الـ PCR   :-

1- الانفصال (denaturation ) :-

- يتم خلالها فصل الـ  DNA الى شريطين منفصلين عبر تكسير الروابط الهيدروجينية .

2- الالتحام (annealing)  :-

-  ارتباط primers  بالشريطين المنفصلين .

3 -  التمدد (extension)  :-

- يقوم TAG polymerase بإضافة dNTPs الى الجزء المرتبط بالـ primer وعمل شريط ثناتي .

pcr 1

*بعد كل مرحلة  (cycle) يكون الجزء المحدد أو الجين (gene) المراد نسخة قد تضاعف .

* في حالة RNA , فإنه يحتاج الى عملية إضافية لتحويلة الى شريطين وتسمى هذه الخطوة بـ  Reverse Transcription .

* يتم الكشف عن ناتج PCR عبر تقنية الرحلان الكهربائي كخطوة اضافية تتم بعد انتهاء عملية النسخ . لكن في حالة RT-PCR , يتم الكشف عن ناتج الـ  PCR  بينما تكون عملية النسج جارية . لهذا يسمى بـ (Real Time (RT .

pcr 2
Real Time -PCR :-
- يتميز هذا النوع  بأنه يمنح الفرصة لمتابعة تقدم عمليه النسج وقت حدوثها . تكمن الطريقة عبر استخدام جزيئات مشعة (fluorescent dyes)  تسمى بـ probe ترتبط سواءً بالـ DNA أو بالجزء المراد نسخة  . تعتبر مقدرة هذا النوع اعلى في الكشف عن الكميات القليلة من الـ DNA الموجودةفي العينة  من تقنية الرحلان الكهربائي .  كلما ازداد اشعاع الجزيات المشعة كلما دل ذلك وجود كميات اعلى  من الـ DNA .

*بعض انواع الجزيأت المشعة :-

pcr 32

* استخدامات RT-PCR :-

- الكشف عن الميكروبات وتحديد كمياتها

- الكشف عن الطفرات الجينية

- تحديد النمط الجيني (genotyping)
pcr 4

slide0085_image051

 * الفرق بين probe  و primer   ؟

  – النيكليوتايد عبارة عن وحدة بناء الحمض النووي بحيث يكون DNA  مكون من سلسلة متصلة من النيكليوتيدات . يوجد اربع انواع من النيكليوتايد في DNA  وتختلف وفقاً لنوع القاعدة النيتروجينية (A ,T ,C,G)   . معرفة ترتيب  النيكليوتيدات أو ما يسمى بـ (sequence)  اصبح ذو فائدة كبيرة سواءً في تشخيص العديد من الامراض الاوراثية أو الكشف عن الميكروبات .     يتكون   DNA  من شريطين متوازيين متكاملين ( كل نيوكليوتايد في الشريط الاول يقابله نيوكليوتايد محدد ومعروف في الشريط الآخر)  . عند انفصال الشريطين , تصبح فرصة الارتباط بالشريط الوراثي ممكنة وهذا ما يحدث بالنسبة لـ Probe  و Primer    . يتشابهة probe  و primer   بأنهما عبارة عن شريط واحد من DNA ( سلسلة محددة من النيكليوتيدات )  تختلف في حجمها وفقاً لأغراض مختلفة . كلاهما يعملان على الارتباط بالجزء المكمل على شريط DNA   . يختلف هذان المصطلحان من ناحية استخدامهما فمصطلح probe   يكون الهدف منه  الكشف عن  الحمض النووي  لذلك عادةً ما يتم ارتباط  Probe بمواد تساعد على التعرف عليه كالمواد المشعة .  أما مصطلح primer  فيقصد به تحديد بداية تصنيع الحمض النووي على الشريط الوراثي لأن انزيمات البوليميراز لا تستطيع بدء بناء شريط وراثي جديد ما لم يتم البدء بتحديد مكان البداية وهذا يكون عمل primer . 

* مصطلحات مهمة في  RT-PCR :-

Threshold :-

-  عبارة عن كمية الاشعاع المطلوبة الصادرة من العينة  والتي يتم استقبالها عبر المستقبلات . تعتبر هذه الكمية قليلة وهذا مايجعلها اكثر حساسية من تقنية الرحلان الكهربائي .

threshold cycle  :-

- هي الدورة التي تم الكشف عن الاشعاع فيها . فإذا كانت TC  قليلة , فهذا يدل على أن كمية DNA عاليةوالعكس صحيح .

pcr 5

*الفيديو التالي يشرح تقنية PCR  بطريقة سهلة وميسرة

المصادر :-

1-  http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture13/Lecture13.html

2- http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

6 تعليقات »

  1. زهور 25 مايو, 2013 في 11:44 ص - Reply

    انا طالبة ماجستير بحاجة الى بحث او رسالة ماجستير حول داء الابواغ الخبيئة البي سي ار

  2. سنان 4 يونيو, 2013 في 8:21 م - Reply

    مشكوووووور رائع ومعلومه مفيده

  3. marwa 27 يوليو, 2013 في 1:20 م - Reply

    شكرا على المقال

  4. rashali 20 سبتمبر, 2013 في 1:06 ص - Reply

    الله يعطيك العافيه يارب كتييييير حلو ومفيد

  5. صرخه ندم 25 سبتمبر, 2013 في 10:56 م - Reply

    بارك الله فيك

  6. salhasmialamir 28 سبتمبر, 2013 في 6:29 م - Reply

    رائع الموضوع الله يعطيك العافية شكرا

اكتب رد »

Google+